摘要：本文根据审评过程中发现的含抑菌成分制剂在进行无菌检查中存在的一些问题，并结合2005版中国药典二部中无菌检查方法学验证研究的内容，提请申报单位注意在后续品种的研发和申报过程中对所采用的无菌检查进行方法学验证，以保证无菌制剂的无菌性。

  无菌检查法系用于检查药典要求无菌的药品、医疗器具、原料、辅料及其他品种是否无菌的一种方法。若供试品符合无菌检查的规定，仅表明了供试品在该检验条件下未发现微生物污染。因而2005版中国药典新增了无菌检查方法验证试验，旨在：1）确认所采用的方法适合于供试品的无菌检查。即确认供试品在该检验量、该检验条件下无抑菌活性或其抑菌活性以被充分消除到可忽略不计。 2）保证检验结果的准确、可靠及检测验证的方法的完整性。

  审评中我们注意到，部分含抑菌成分的制剂其进行的无菌检查存在一些问题，如抗生素注射剂无菌检查方法中仅简单的提及采用薄膜过滤法应符合相关规定，并未详细说明冲洗液的用量、试验菌株等；同一品种不一样的规格的制剂均采用同一冲洗量进行薄膜过滤，其结果是无法完全排除抑菌成分的影响。这样一些问题使得我们对含抑菌成分制剂的无菌检查结果是否能达到目的产生担忧。本文对含抑菌成分制剂的无菌检查中涉及的有关问题做简要介绍，使研发者增进对无菌检查法的认识，提高药物研发水平。

  关于需进行无菌检查的无菌制剂，中国药典2005年版共包含10种剂型，分别为：1）注射剂， 2）眼内注射溶液、眼内插入剂及供手术、伤口、角膜穿通用的眼用制剂， 3）用于烧伤、创伤或溃疡的气雾剂、喷雾剂，4）用于烧伤或创伤的局部用散剂，5）用于手术、耳部伤口或耳膜穿孔的滴耳剂与洗耳剂6）用于烧伤或创伤的鼻用制剂，7）用于冲洗开放性伤口或腔体的无菌溶剂，8）用于烧伤或严重创伤的软膏剂及乳膏剂，9）用于严重创伤的凝胶剂，10）植入剂。其中水溶性含抑菌成分的无菌制剂包括1）～7），非水溶性含抑菌成分的无菌制剂包括8）和9）。含抑菌成分制剂的水溶性无菌制剂的检查方法一般都会采用直接薄膜过滤法，非水溶性无菌制剂的检查方法采用加入乳化剂聚山梨酯80或十四烷酸异丙酯等萃取后再薄膜过滤。

  验证的类型包括：1）前验证：指建立药品无菌检查法时进行的验证；2）再验证：对检测验证的方法进行修订时进行的验证；3）定期的方法验证：供试品的组分或原检验条件发生改变可能会影响检验结果时进行的验证 。

  方法学验证试验的内容：2005版增加了1）验证试验：薄膜过滤法的抑真菌、抑细菌验证试验和供试品的处理项验证试验，以验证所采用的方法和条件是否适合于供试品的无菌检查；2）对验证用菌株的要求：验证用菌株为金黄色葡萄球菌、铜绿色假单胞菌、枯草杆菌、生孢梭菌、白色念珠菌、黑曲霉；对菌种的要求为不允许超出5代；采用适宜的方法保存；加菌量：＜100cfu。3）详细的验证方法：含抑菌成分的制剂应采用薄膜过滤法，具体操作是将规定量的供试品按薄膜过滤法过滤，冲洗，在最后一次的冲洗液中加入小于100cfu的试验菌，将培养基加至滤筒内，另取一含等量培养基滤筒，加入等量试验菌作为阳性对照，按规定温度培养3－5天，各试验菌同法操作；4）结果判断：在含供试品各容器中的试验菌均生长良好，则供试品照此检查法和检查条件进行供试品的无菌检查法检查；如含供试品的任一容器中微生物生长微弱、缓慢或不生长，可采用增加冲洗量，增加培养基的用量，使用中和剂或灭活剂或更换滤膜品种等方法，并重新进行方法验证。

  需关注的问题：1）菌株选择的原则为有代表性、普遍性、易存活、低或非致病性的标准菌株(或该药品中常见的污染菌)，对每一试验菌应逐一验证；2）若需使用表面活性剂、灭活剂、中和剂等试剂，应证明其有效性，且对微生物生长及存活无影响；3）稀释液、冲洗液的品种须保护样品中有几率存在的微生物，增加检出率；4）确定检验数量及检验量，检验数量是指一次检验所用供试品最小包装容器的数量；检验量是指一次试验所用的供试品总量（g/ml）；5）注意对供试品的处理，在对β-内酰胺类抗生素供试品处理时，因抗生素的取样量使冲洗液的用量需1500－2000ml，对有几率存在的菌有杀伤作用，可考虑用含适量的β-内酰胺酶的冲洗液清除残留在滤筒、滤膜上的抗生素后接种培养基，或将滤膜直接接种至含适量的β-内酰胺酶的培养基；在对可溶于十四烷酸异丙酯的膏剂和粘性油类供试品（如用于烧伤或严重创伤的软膏剂及乳膏剂等）做处理时，无菌的十四烷酸异丙酯用量需经方法学验证。

  2005版中国药典附录的无菌检查法较2000版有较大改动，增加了无菌检查中方法学验证研究内容，增加了试验的可操作性，方法更具科学性，提高检出率，保证检验结果的准确性。建议申报单位在后续品种的研发和申报过程中对所采用的无菌检查进行方法学验证，以保证无菌制剂的无菌性。