阪崎肠杆菌荧光PCR检测验剂盒适合于增菌培育物、疑似病料及食物中阪崎肠杆菌(ESKZ)的检测。阪崎肠杆菌(Enterobacter sakazakii)是乳制品中近几年新发现的一种致病菌。它是存在自然环境中的一种“条件致病菌”，已被世界卫生组织和许多国家确定为引起婴幼儿逝世的重要条件致病菌，可导致任何年龄层人群的疾病，尤其是对早产儿、出世体重轻的婴儿或免疫受损婴儿的要挟最大，严重者可导致败血症、脑膜炎或坏死性小肠结肠炎。本办法为荧光PCR检测的新办法，反响在同一管内接连进行，简略易操作，并有很大作用预防了污染，能对样品中或预培育液中的阪崎肠杆菌进行快速检测，具有特异性高、敏感性强和操作简略快捷的特色。

  ?食物样品：样品的收集与预培育依照样品的收集与预培育依照《食物卫生微生物学查验阪崎肠杆菌查验(GB/T 4789.40-2008)要求进行。

  ?血液样品：用无菌注射器抽取受检者静脉血2mL，注入无菌EDTA2Na(或柠檬酸钠)抗凝管，当即混匀。

  可采用PCR试剂盒装备的DNA抽提液，按以下阐明进行DNA核酸的粗提。也可收购北京百奥莱博科技有限公司出产的DNA提取试剂盒(过柱法-荧光配套)或其他适宜的商业化产品，并依照相应试剂盒阐明进行操作。

  ?液体培育物：取液体培育物100μL加到1.5mL无菌离心管中，8000rpm离心3min，尽量吸弃上清，参加50μL DNA抽提液充沛混匀，100℃恒温10min，13000rpm离心3min，取上清5μL进行PCR反响。

  ?固体培育物：挑取单克隆菌落与50μL DNA抽提液充沛混匀，100℃恒温10min，13000rpm离心3min，取上清5μL进行PCR反响。

  ?粪便样品：挑取米粒巨细粪便于灭菌离心管中，参加0.5mL生理盐水，振动混匀，13000rpm离心3分钟，弃上清，沉积中参加50μL DNA抽提液充沛混匀，100℃恒温10min，13000rpm离心3min取上清5μL进行PCR反响。

  注：阳性对照和阴性对照为现已抽提好的核酸(无需提取)，直接取5μL参加到反响系统中即可。因为阳性对照浓度较高，主张最终在样品制备区域参加阳性对照。

  设所需求的PCR反响管管数为N(N=样本数+1管阴性对照+1管阳性对照)，每个测验反响系统制造如下表：

  试剂每个反响参加的量N个反响参加的量荧光PCR反响液14 μLN×14μL酶混合物1 μLN×1 μL总量15 μLN×15μL

  计算好各试剂的使用量，参加一恰当体积洁净离心管中，充沛混匀，10000rpm离心10s，向设定的N个PCR反响管平分别参加15μL，向每管中参加处理后样品或阴性对照(NTC)和阳性对照(ESKZ -PTC)5μL，10000rpm瞬时离心10秒。

  直接读取检测成果。基线和阈值设定准则依据仪器噪声状况做调整，以阈值线刚好超越正常阴性样品扩增曲线．

  ?在实验建立的条件下，Ct值≤35的样本为阳性，标明阪崎肠杆菌核酸阳性。

  ?假如35＜Ct值≤40，判为可疑样品。关于可疑样品，先看扩增曲线。假如扩增曲线为对数扩增曲线，则为可疑阳性，不然判为阴性。

  ?关于可疑阳性样品，惩罚抽提核酸，再次进行阪崎肠杆菌real time PCR检测。假如重复扩增曲线为对数扩增曲线，判为样本阳性，标明阪崎肠杆菌核酸阳性；不然判为样本阴性。

  ?PCR操作应严厉依据相关要求分区(试剂制造区、标本处理区、PCR扩增区等)，避免实验室污染。

  ?试剂盒里一切物品应视为污染物对待，依照卫生部《微生物生物医学实验室生物安全公例》做处理。